Interpretatie van RTPCR-testprincipes en COVID19-risico

Nu de COVID-19-pandemie wereldwijd uitdagingen blijft opleveren, blijft RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) testen de gouden standaard voor het diagnosticeren van SARS-CoV-2-infectie. Maar hoeveel mensen begrijpen echt de wetenschappelijke principes achter deze cruciale diagnostische tool? Dit artikel geeft een diepgaande maar toegankelijke uitleg van RT-PCR-testen, waardoor zowel medische professionals als het grote publiek deze essentiële technologie beter kunnen begrijpen.

RT-PCR, of Real-Time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, is een zeer gevoelige en snelle moleculair biologische techniek die wordt gebruikt om specifiek genetisch materiaal in monsters op te sporen. Dit genetisch materiaal kan afkomstig zijn van mensen, bacteriën of virussen zoals SARS-CoV-2.

De kerntechnologie achter RT-PCR is PCR, uitgevonden door Kary B. Mullis in de jaren 80 (wat hem een Nobelprijs opleverde). PCR amplificeert en detecteert specifieke DNA-doelen. Latere verbeteringen maakten "real-time" visualisatie en kwantificering van DNA-doelen tijdens amplificatie mogelijk. Bij real-time PCR correleert de fluorescentie-intensiteit van gespecialiseerde probes met de hoeveelheid geamplificeerd DNA.

Standaard PCR detecteert echter alleen DNA. Omdat SARS-CoV-2 RNA genetisch materiaal bevat, vereist de test het enzym reverse transcriptase om RNA om te zetten in complementair DNA (cDNA). Deze reverse transcriptie stap, gecombineerd met real-time PCR, maakt RT-PCR een krachtig hulpmiddel voor het detecteren van RNA-virussen zoals SARS-CoV-2.

Het begrijpen van RT-PCR vereist basiskennis van genetisch materiaal - de handleiding die het cellulaire en virale gedrag, overleving en reproductie regelt. Genetisch materiaal komt in twee primaire vormen: DNA (deoxyribonucleïnezuur) en RNA (ribonucleïnezuur). DNA heeft een dubbelstrengs structuur, terwijl RNA enkelstrengs is. Voor diagnostische doeleinden is de grotere stabiliteit van DNA wenselijk voor het testen op infectieziekten. Met name SARS-CoV-2 bevat alleen RNA.

Alle virussen delen de eigenschap dat ze afhankelijk zijn van gastheercellen voor overleving en replicatie. SARS-CoV-2, net als andere virussen, dringt gezonde cellen binnen om zich voort te planten. Wanneer een infectie optreedt, geeft het virus zijn RNA vrij en kaapt het cellulaire machinerie voor replicatie. Zolang viraal genetisch materiaal in cellen blijft, kan RT-PCR SARS-CoV-2-infectie detecteren.

Getrainde zorgverleners verzamelen nasofaryngeale swabmonsters, die vervolgens in steriele buizen worden geplaatst die viraal transportmedium bevatten om de virale integriteit te behouden.

In het laboratorium extraheren onderzoekers RNA met behulp van commerciële zuiveringskits. Het RNA-monster wordt vervolgens toegevoegd aan een reactiemengsel dat alle benodigde componenten voor testen bevat, waaronder DNA-polymerase, reverse transcriptase, DNA-bouwstenen en SARS-CoV-2-specifieke fluorescerende probes en primers.

Omdat PCR alleen werkt met DNA-templates, zet reverse transcriptase al het RNA in het monster (inclusief menselijk, bacterieel, ander coronavirus RNA en mogelijk SARS-CoV-2 RNA) om in cDNA.

Dit proces omvat drie herhalende stappen:

• Denaturatie: Het verwarmen van DNA tot >90°C gedurende ongeveer 10 minuten scheidt dubbelstrengs DNA in enkelvoudige strengen.
• Primer Annealing: Speciaal ontworpen korte DNA-fragmenten (primers) hechten zich bij lagere temperaturen aan specifieke SARS-CoV-2 cDNA-doelen. Veelvoorkomende COVID-19-geendoelen zijn onder meer RNA-afhankelijke RNA-polymerase (RdRP), ORF1ab, S-gen (spike-eiwit), N-gen (nucleocapside) en E-gen (envelop).
• Extensie: DNA-polymerase gebruikt primers als startpunten om identieke kopieën van doel-DNA-segmenten te maken.

Het proces herhaalt zich doorgaans 40 keer, waarbij het doel-DNA bij elke cyclus wordt verdubbeld. Fluorescerende probes binden zich stroomafwaarts van primers en geven detecteerbare signalen af bij elke DNA-amplificatie. Toenemend doel-DNA correleert met toenemende fluorescentie-intensiteit.

De fluorescentiegegevens genereren een "Cycle Threshold" (Ct)-waarde - het aantal cycli dat nodig is om het signaal de achtergrondniveaus te laten overschrijden. Monsters met meer doel-DNA amplificeren sneller, waardoor er minder cycli nodig zijn (lagere Ct-waarden). Omgekeerd vereist schaars doel-DNA meer cycli (hogere Ct-waarden).

Ct-waarden leveren cruciale informatie over de virale lading. Lagere Ct-waarden duiden op hogere hoeveelheden viraal genoom, terwijl hogere waarden op lagere hoeveelheden wijzen. Zorgverleners combineren Ct-waarden met klinische symptomen en voorgeschiedenis om het ziektestadium te beoordelen. Seriële Ct-waarden van herhaalde tests helpen bij het volgen van de progressie van de ziekte en het voorspellen van herstel. Contactonderzoekers gebruiken ook Ct-waarden om patiënten met de hoogste virale ladingen (en dus het grootste transmissierisico) prioriteit te geven.

• Virale lading: Ct-waarden correleren omgekeerd met de virale lading - lagere Ct betekent dat er meer virus aanwezig is.
• Ziektestadium: Vroege infectie toont doorgaans hoge virale ladingen (lage Ct), terwijl latere stadia afnemende ladingen (stijgende Ct) vertonen naarmate het immuunsysteem de infectie opruimt.
• Transmissierisico: Hogere virale ladingen (lagere Ct-waarden) duiden op een groter transmissiepotentieel, wat strengere isolatiemaatregelen rechtvaardigt.

Ondanks dat het de diagnostische gouden standaard van COVID-19 is, heeft RT-PCR beperkingen:

• Vals-negatieven: Onjuiste bemonstering, lage virale ladingen of vroegtijdig testen kunnen negatieve resultaten opleveren ondanks daadwerkelijke infectie.
• Vals-positieven: Zeldzame maar mogelijke positieve resultaten zonder daadwerkelijke infectie.
• Standaardisatie-uitdagingen: Verschillende laboratoria en platforms kunnen verschillende Ct-drempels gebruiken, wat vergelijkingen bemoeilijkt.

RT-PCR-testen blijven essentieel voor de diagnose van COVID-19 door SARS-CoV-2 genetisch materiaal te detecteren. Ct-waarden dienen als essentiële indicatoren van virale lading, ziekteprogressie en transmissierisico. De testbeperkingen vereisen echter dat resultaten worden gecombineerd met klinische evaluatie voor een nauwkeurige diagnose en behandeling.