PCR vs Qpcr Belangrijkste verschillen in principes en toepassingen

Gene-amplificatietechnologie, vaak beschreven als de "fotokopie-machine" van het biologische veld, speelt een cruciale rol in ziekte-diagnose, genetisch onderzoek en andere wetenschappelijke domeinen.Onder deze technologieënDe resultaten van deze studie zijn gebaseerd op de resultaten van de onderzoeksprocedure van de Europese Commissie voor de ontwikkeling van de PCR- en qPCR-technologie.De resultaten van de studie zijn gebaseerd op de resultaten van de onderzoekers en in het bijzonder op hun data-analysebenaderingen om onderzoekers te helpen geïnformeerde beslissingen te nemen..

De polymeraseketenreactie (PCR) is een in vitro-techniek voor het versterken van specifieke DNA-fragmenten.PCR maakt gebruik van herhaaldelijk verwarmings- en koelingscycli om de doelDNA-sequenties exponentieel te verhogenDe kern van de technologie ligt in het primerontwerp van korte sequenties die complementair zijn aan de uiteinden van het DNA-doel dat DNA-polymerasen begeleidt om specifieke gebieden te repliceren.

1. Denaturatie:Het opwarmen van het DNA-monster (94-98°C) scheidt dubbelstrengig DNA in enkele strengen.
2. Verzilvering:Temperatuurreductie (50-65°C) maakt het mogelijk dat primers zich binden aan doelreeksen.
3. Verlenging:Bij de optimale temperatuur van de polymerase (72°C) worden nieuwe DNA-strengen gesynthetiseerd uit de primers.

PCR-producten worden doorgaans geanalyseerd door middel van agarose-gel-elektroforese, die fragmenten op grootte scheidt.

• Genkloning:Versterking van specifieke genen voor recombinant DNA-constructie
• DNA-sequencing:Het verstrekken van voldoende DNA-sjabloon
• Diagnose ziekte:Het opsporen van pathogenen of genetische mutaties
• Forensisch onderzoek:DNA-vingerafdrukken

Quantitative PCR (qPCR) of real-time PCR is een geavanceerde versie die de DNA-amplificatie real-time controleert, waardoor nauwkeurige kwantificatie mogelijk is.Deze technologie gebruikt fluorescerende markers die samenhangen met DNA-concentratie..

• Fluorescerende kleurstoffen:SYBR Groen bindt dubbelstreng DNA, met toenemende fluorescentie tijdens versterking.
• Fluorescerende sondes:Sequentie-specifieke sondes stralen alleen fluorescentie uit als ze aan doelen gebonden zijn.

De kwantitatie is gebaseerd op de drempelwaarde van de cyclus (Ct-waarde) - het cyclusnummer wanneer de fluorescentie de achtergrond overschrijdt.

• Relatieve kwantificatie:Het vergelijken van de doelgenexpressie tussen monsters met behulp van referentiegenen voor normalisatie
• Absolute kwantificatie:Het bepalen van het exacte aantal DNA-kopieën met behulp van standaardcurven van bekende concentraties

• Genexpressie analyse:Meting van mRNA-niveaus
• Detectie van pathogenen:Kwantificatie van virale/bacteriële ladingen
• Drugontwikkeling:Beoordeling van farmacologische effecten op de genexpressie
• Onderzoek naar kanker:Het opsporen van tumorbiomarker

Omgekeerde transcriptie PCR (RT-PCR) zet RNA om in complementair DNA (cDNA) voor latere amplificatie, waardoor RNA-detectie mogelijk is.

• RT-PCR in één stap:Combineert omgekeerde transcriptie en PCR in één buis
• RT-PCR in twee stappen:Verricht opeenvolgende reacties

Het combineren van RT-PCR met qPCR creëert RT-qPCR, de gouden standaard voor mRNA-quantificatie in genexpressieonderzoeken.

PCR-analyse omvat een eenvoudige gelvisualisatie van DNA-banden, die aanwezigheid/afwezigheid en relatieve overvloed aantoont door middel van bandintensiteit.

De qPCR-analyse levert een geavanceerde kwantificatie door middel van Ct-waarden, waarbij:

• Begincorrectie om rekening te houden met fluorescentie op de achtergrond
• Precieze drempelwaarde voor nauwkeurige bepaling van Ct
• Analyse van de smeltcurve om de amplificatiespecificiteit te controleren

Voor relatieve kwantificatie is een goede selectie en normalisatie van referentiegen cruciaal, terwijl absolute kwantificatie hoge kwaliteit van standaardcurven vereist.

De keuze tussen PCR en qPCR is afhankelijk van de onderzoeksdoelstellingen:

• Genexpressie:RT-qPCR
• Detectie van pathogenen:qPCR
• Genkloning:PCR
• DNA-sequencing:PCR

PCR is voldoende voor de detectie van aanwezigheid/afwezigheid, terwijl qPCR essentieel is voor nauwkeurige kwantitatieve vereisten.